DAP-seq助力揭示GhRCD1促進棉花對鎘的耐受調節機制

鎘（Cd²⁺）是環境中最常見的有害重金屬之一，嚴重威脅作物生產力和質量以及食品安全。Cd²⁺容易被植物從土壤中吸收，并通過可食用的植物器官和谷物進入食物鏈，對食品質量、糧食安全和公共安全構成威脅。

植物修復是減少土壤污染的有效途徑之一。棉花作為一種重要的非食用經濟作物，與糧食作物（小麥、水稻和玉米）、油料作物（花生和大豆）和蔬菜（豆類、黃瓜和番茄）相比，在修復土壤Cd²⁺污染方面具有天然優勢，避免了Cd²⁺進入食物鏈的風險。因此，探究棉花響應鎘脅迫的調控機制至關重要。

2024年1月16日，中國農業科學院棉花研究所李付廣研究員團隊的研究成果，發表在Plant Biotechnology Journal期刊上（IF=13.8），文章題目是“GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1 transcriptional cascade" 。該研究使用DNA親和純化測序（DAP-seq）等分子相互作用研究方法，發現了調節棉花Cd2+耐受性的分子級聯反應，揭示了GhRCD1通過調控GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1轉錄級聯通路響應鎘脅迫的分子機制，為培育耐鎘棉花新品種和通過植物修復手段降低鎘污染提供了新思路。

1.突變ghrcd1 基因降低棉花Cd²⁺耐受性

為探究Cd²⁺對棉花毒性的分子機制，作者通過T-DNA插入得到對Cd²⁺敏感的突變體ghrcd1。Cd²⁺處理后，通過表型觀察，RT-qPCR分析，PI染色，葉綠體結構觀察，SPAD分析等實驗發現，ghrcd1幼苗比WT植株表現出更低的Cd²⁺耐受性，這表明，抑制GhRCD1表達會降低棉花Cd²⁺耐受性，GhRCD1在棉花應對鎘脅迫時具有正向調節作用。

2.敲除棉花GhRCD1基因，降低棉花Cd²⁺耐受性

為了進一步研究GhRCD1在棉花耐鎘脅迫中的作用，作者構建了KO-GhRCD1株系和OE-GhRCD1株系。Cd²⁺處理后，通過表型觀察，PI染色，葉綠體結構觀察，SPAD分析等實驗發現，與WT相比，KO-GhRCD1的Cd²⁺耐受性更低，OE-GhRCD1的Cd²⁺耐受性更高。這些結果表明GhRCD1能減弱Cd²⁺對棉花的毒性。

3.GhRCD1與GhbHLH12在體外和體內均存在相互作用

作者使用GhRCD1為誘餌蛋白，對棉花應激響應蛋白庫進行Y2H篩選，結果發現GhbHLH12轉錄因子與GhRCD1存在相互作用。而后通過BiFC、GST pull down和LCI實驗進一步驗證了這一結果。這些結果表明GhRCD1與GhbHLH12在體外和體內都能與GhbHLH12相互作用。

4.抑制GhbHLH12表達增強棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhbHLH12是否參與了棉花應對Cd²⁺脅迫的反應，作者構建了棉花的OE-GhbHLH12株系和GhbHLH1-RNAi株系。Cd²⁺處理后，GhbHLH1-RNAi的Cd²⁺耐受性增加，OE-GhbHLH12的Cd²⁺耐受性降低。為確定GhbHLH12在調節Cd²⁺耐受性中是否有基因依賴性，作者敲除GhbHLH12得到KO-GhbHLH12株系，Cd²⁺處理后，KO-GhbHLH12植株比對照植株具有更高的耐受性。這些結果說明，抑制GhbHLH12表達增強了棉花的Cd²⁺耐受性。

5.GhRCD1減弱GhbHLH12對GhMYB44的轉錄抑制作用，提高棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhbHLH12抑制棉花Cd²⁺耐受性的機制，作者對WT幼苗進行了RNA-seq和DAP-seq聯合分析。DAP-seq結果顯示GhbHLH12在GhMYB44的啟動子區域有顯著富集，而后，Y1H和EMSA實驗證實了GhbHLH12蛋白和GhMYB44的結合基序G-box相互作用。LUC/REN報告實驗表明GhbHLH12抑制GhMYB44的轉錄，而GhRCD1可以減弱GhbHLH12對GhMYB44的抑制作用，EMSA結果也表明GhRCD1減弱了GhbHLH12與GhMYB44的結合，結合RT-qPCR實驗結果，說明GhRCD1和GhbHLH12分別是Cd²⁺耐受性的正負調節因子，并且在Cd²⁺脅迫下，轉錄調控存在復雜的相互作用。

6.GhMYB44表達增強棉花Cd²⁺耐受性

為探究GhMYB44響應Cd²⁺脅迫的機制，作者構建了GhMYB44-OE1/5株系和GhMYB44-SRDX1/6株系。Cd²⁺處理后，與WT相比，GhMYB44-OE表現出更高的Cd²⁺耐受性，而SRDX-GhMYB44-1/6植株表現出更低的耐受性。這表明GhMYB44表達增強了棉花的Cd²⁺耐受性。隨后作者采用VIGS技術沉默對照和KO-GhbHLH12株系中的GhMYB44基因，結果表明GhMYB44在GhbHLH12的下游發揮作用。

7.棉花應對Cd²⁺脅迫的GhMYB44–GhHMAs轉錄級聯反應

為探究棉花中GhMYB44提高Cd²⁺耐受性的作用機制，作者利用DAP-seq技術找到GhMYB44的10207個潛在結合位點，其中61.42％位于基因間區，22.31％位于啟動子區。GO分析顯示，靶基因顯著富集在脅迫應答（GhWRKY13和GhWRKY51）和金屬離子結合和運輸（GhHMA1、GhHMA2和GhHMA5）通路。為研究GhMYB44是否通過GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺轉運中發揮調控作用，作者通過Y1H、EMSA實驗驗證了GhMYB44特異性結合GhHMA１和GhHMA5的G-box（CATGTG）順式作用元件。LUC/REN報告實驗結果表明，GhMYB44可以直接激活GhHMA1和GhHMA5的轉錄來調控Cd²⁺的轉運。RT-qPCR分析表明Cd²⁺誘導GhHMA1和GhHMA5的上調在很大程度上取決于GhMYB44和KO-bHLH12的存在和功能。

為進一步探究GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺耐受機制中的生物功能，作者采用VIGS技術沉默棉花中的GhHMA1和GhHMA5基因，生成沉默品系，Cd²⁺處理后，沉默品系對Cd²⁺表現出更高的敏感性。結果表明GhMYB44-GhHMA1/5信號級聯反應正向調控棉花的Cd²⁺耐受性。

8.GhMYB44和GhPYL8協同調節ABA介導的Cd²⁺耐受性

為研究GhMYB44是否與ABA受體相互作用介導Cd²⁺耐受性，作者進行Y2H測定發現GhMYB44與ABA受體GhPYL8相互作用。隨后通過BiFC和蛋白pull-down實驗驗證了這一結果。為研究GhPYL8的生理功能，作者構建了OE-GhPYL8-1/3/6株系，Cd²⁺處理后，與WT相比，OE - GhPYL8對Cd²⁺的耐受性更高。這些結果表明GhMYB44可以與GhPYL8相互作用來調節ABA介導的Cd²⁺耐受性。

小結：

本研究揭示了一個調控級聯反應，即GhRCD1–GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1，闡明了棉花耐Cd²⁺遺傳調控的分子機制，為棉花耐Cd²⁺優良品種的開發奠定了基礎，預示著棉花植物修復的新時代。