DAP-seq助力揭示轉(zhuǎn)錄因子在草地貪夜蛾Bt抗性中重要作用

2024年4月6日，武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院劉磊磊課題組在International Journal of Biological Macromolecules（中科院一區(qū)，影響因子8.2）期刊在線發(fā)表了“Contribution of the transcription factor SfGATAe to Bt Cry toxin resistance in Spodoptera frugiperda through reduction of ABCC2 expression"的研究論文。該團(tuán)隊(duì)利用DAP-seq等技術(shù)闡明了轉(zhuǎn)錄因子SfGATAe對(duì)毒素受體基因SfABCC2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，并全面闡釋了這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)草地貪夜蛾Bt抗性產(chǎn)生的重要影響。這項(xiàng)研究為探索SfGATAe在抗性機(jī)制中的作用，并為開(kāi)發(fā)以SfGATAe為靶點(diǎn)的生物農(nóng)藥奠定了重要理論基礎(chǔ)。

ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于多次跨膜蛋白，其不同情況的突變能引起機(jī)體對(duì)Bt毒素不同程度的抗性，SfABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的草地貪夜蛾對(duì)Bt毒素抗性研究具有重要的意義。而鱗翅目昆蟲(chóng)中特異性毒素受體的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控與昆蟲(chóng)Bt抗性關(guān)系知之甚少，GATA轉(zhuǎn)錄因子屬于鋅指蛋白家族，包含位于 NH2 末端區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活域、兩個(gè)高度保守的鋅指區(qū)域、一個(gè)核定位信號(hào)序列和一個(gè)未知功能的 COOH 末端域， GATAe 通過(guò)調(diào)節(jié)中腸組織特異性基因的表達(dá)，參與中腸干細(xì)胞的發(fā)育和分化。

圖1草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系中的亞細(xì)胞定位分析

該研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用了DAP-seq技術(shù)，以高通量、高分辨率的鑒定了SfGATAe的直接轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。該研究共識(shí)別出了19,740個(gè)結(jié)合峰，其中1,507個(gè)位點(diǎn)位于啟動(dòng)區(qū)。該研究通過(guò)構(gòu)建一系列截短載體，并利用雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)評(píng)估了每個(gè)構(gòu)建對(duì)報(bào)告基因的驅(qū)動(dòng)能力，并成功鑒定了調(diào)控元件的關(guān)鍵區(qū)域。通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)、DNA pull down和定點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)，確定了轉(zhuǎn)錄因子SfGATAe在ABCC2靶基因中的核心控制位點(diǎn)。

圖2 SfGATAe 與ABCC2受體啟動(dòng)子結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域鑒定

圖3 SfGATAe結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)的DNA基序鑒定

轉(zhuǎn)錄因子SfGATAe在草地貪夜蛾時(shí)空表達(dá)分析表明，SfGATAe的在中腸表達(dá)水平都顯著高于非中腸器官，中腸中SfGATAe的增強(qiáng)表達(dá)可能表明其參與調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)代謝或解毒過(guò)程，尤其在調(diào)控Cry1Ac毒素受體ABCC2方面的重要作用。

圖4 SfGATAe在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段和各部位時(shí)空表達(dá)模式

SfGATAe表達(dá)水平降低導(dǎo)致SfABCC2受體表達(dá)減少，進(jìn)而導(dǎo)致幼蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac毒素的敏感性降低。SfGATAe與SfABCC2基因啟動(dòng)子內(nèi)的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合調(diào)節(jié)了SfABCC2蛋白的表達(dá)。SfGATAe在腸道內(nèi)表現(xiàn)出高水平表達(dá)，敲降SfGATAe表達(dá)，幼蟲(chóng)體內(nèi)SfABCC2的表達(dá)降低。該研究加強(qiáng)了對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)中ABCC2的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控的理解，為進(jìn)一步探索SfGATAe在調(diào)控Cry1Ac和其他殺蟲(chóng)劑抗性機(jī)制中的功能奠定基礎(chǔ)。

圖5 抑制SfGATAe表達(dá)量減少ABCC2表達(dá)水平導(dǎo)致草地貪夜蛾對(duì)Bt抗性