ChIP-seq染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序常見問(wèn)題
1. Input和IP樣本之間的關(guān)系是什么？
Input和IP屬于兩個(gè)樣本，在前期檢測(cè)、建庫(kù)、測(cè)序都是平行進(jìn)行的，但是分析中需要將兩個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，得出終的peak結(jié)果，并進(jìn)行后續(xù)分析。
2. Input是什么？有什么作用？
我們將DNA或者RNA fragmentation后，在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照（不進(jìn)行免疫沉淀過(guò)程）。Input是斷裂后的基因組DNA或者RNA，需要與沉淀后的樣品DNA/RNA一起經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA/RNA純化，以及后的PCR或其他方法檢測(cè)。通過(guò)后續(xù)數(shù)據(jù)分析，我們可以通過(guò)Input對(duì)照排除背景噪音（排除因本底表達(dá)水平高或一些非特異性結(jié)合所造成的假陽(yáng)性peaks），驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果和整個(gè)實(shí)驗(yàn)中IP效果，所以Input對(duì)照是IP-seq實(shí)驗(yàn)*的步驟。
3. 陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是什么？
陽(yáng)性對(duì)照
一般用anti-RNA polymerase II抗體，因?yàn)镽NA polymerase II是通用轉(zhuǎn)錄因子，在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，因此理論上，ChIP后PCR會(huì)有條帶。一般陽(yáng)性對(duì)照不進(jìn)行測(cè)序。
陰性對(duì)照
陰性對(duì)照分為mock和Input兩種，二者均能起到減少假陽(yáng)性的作用。mock：用普通IgG為抗體，理論上不會(huì)ChIP下來(lái)任何DNA fragment，因此作為陰性對(duì)照，但是由于非特異性結(jié)合，或者實(shí)驗(yàn)過(guò)程，沒(méi)發(fā)生結(jié)合的DNA清楚不*，可能會(huì)出現(xiàn)條帶，但是一般條帶亮度較弱。IgG不需要進(jìn)行測(cè)序，只是判斷IP試驗(yàn)中所選取的抗體是否特異。
4. ChIP-seq的推薦測(cè)序數(shù)據(jù)量是多少？是否需要設(shè)置重復(fù)？
一般來(lái)說(shuō)，ChIP得到的DNA fragment豐富度較低，大數(shù)據(jù)量測(cè)序意義不大。按照ENCODE目前標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)錄因子建議有20 M以上的可用reads；不同組蛋白標(biāo)準(zhǔn)不一，基本在20 M-45 M可用reads。
ChIP-seq的實(shí)驗(yàn)過(guò)程較為復(fù)雜，早期文章中往往缺少重復(fù)樣本的設(shè)置。不過(guò)為了提高文章結(jié)論的可信度，目前的分析標(biāo)準(zhǔn)中通常推薦有2個(gè)以上的生物學(xué)重復(fù)；對(duì)于樣本較難獲得的情況，可以不設(shè)置生物學(xué)重復(fù)。
5. ChIP實(shí)驗(yàn)中使用的對(duì)照樣本是否也需要測(cè)序？需要哪些對(duì)照？
ChIP富集中常見的對(duì)照包括：
1）input，片段化后未經(jīng)抗體富集的染色質(zhì)后期去蛋白得到的DNA；
2）陽(yáng)性對(duì)照，利用普通組蛋白或RNA聚合酶等陽(yáng)性蛋白抗體進(jìn)行免疫沉淀得到的DNA；
3）陰性對(duì)照，免疫沉淀過(guò)程中不加入抗體或者加入非特異性IgG抗體得到的DNA。
其中，input在數(shù)據(jù)分析時(shí)用于除去背景、進(jìn)行檢峰，是必須要進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序的樣本；陽(yáng)性對(duì)照所用抗體與目標(biāo)蛋白無(wú)關(guān)，不必進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序；陰性對(duì)照理論上基本不會(huì)捕獲到足量DNA，無(wú)法進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。
相關(guān)技術(shù)服務(wù)：
1、 DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）：高通量檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子或DAN結(jié)合蛋白在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。
2、 酵母單雜交：DAP-seq后續(xù)驗(yàn)證服務(wù)。
3、 EMSA：驗(yàn)證蛋白和DNA是否結(jié)合，可用于DAP-seq的后續(xù)驗(yàn)證。
4、 DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析： 分析轉(zhuǎn)錄因子的靶基因在RNA-seq數(shù)據(jù)中的表達(dá)變化，深入挖掘DAP-seq和RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)，增加轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析深度。
5、 DNA-pull down：鑒定與DNA結(jié)合的蛋白。
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